我们的研究根据结果得出，微生物代谢物DCA通过VEGFR2激活促进VM形成和EMT，从而进一步加剧肠道癌变。

  高脂肪饮食（HFD）导致长期暴露于肠道微生物代谢产物次生胆汁酸，如脱氧胆酸（DCA），这与结直肠癌（CRC）紧密关联。有证据说明，血管生成拟态（VM）是癌症恶性转化的关键事件。因此，本研究探讨了DCA在VM调节和肠道癌变过程中的关键作用。研究了HFD对人结直肠癌组织VM形成和上皮-间充质转化（EMT）的影响。在HFD处理的Apcmin/+小鼠中检测粪便DCA水平。然后在体外和体内评估DCA对VM形成、EMT和血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）信号传导的影响。在此我们证明，与正常饮食相比，HFD加重了结直肠癌患者的VM形成和EMT。HFD可改变Apcmin/+小鼠肠道微生物群的组成并明显地增加粪便DCA水平。更重要的是，DCA促进肿瘤细胞增殖，诱导EMT，增加VM的形成，并激活VEGFR2，因此导致肠道癌变。此外，DCA促进HCT-116细胞的增殖和迁移，并诱导EMT过程和试管形成。此外，VEGFR2的沉默减少了DCA诱导的EMT、VM形成和迁移。总之，我们的研究根据结果得出，微生物代谢物DCA通过VEGFR2激活促进VM形成和EMT，从而进一步加剧肠道癌变。

  实验设计图 表1. 按饮食类别选择的结直肠癌患者的基线. 用于实时PCR的引物序列。

  1 高脂饮食加剧了结直肠癌患者的血管生成拟态形成和上皮-间充质转化过程慢慢的变多的证据支持VM与HFD紧密关联。一项队列研究表明，有肝转移的大肠癌患者血清低密度脂蛋白水平明显高于无肝转移的大肠癌患者。此外，HFD可增加小鼠结肠癌的血管生成和转移。为了了解HFD与大肠癌进展之间的关系，我们研究了HFD对大肠癌患者VM和EMT的影响。我们得知患有HFD的CRC患者的VM通道阳性数明显高于患有ND的CRC患者（图1A）。此外，免疫组织化学显示HFD降低了E-钙粘蛋白的表达水平，并提高了波形蛋白的表达

  A. CD34/PAS双重染色用于识别血管生成拟态（VM）和内皮依赖性血管。黄色箭头指向VM+通道（PAS正极和CD34负极通道）。标尺：50μm。B和C，免疫组织化学染色用于区分ND和HFD组之间的EMT相关标记物（E-钙粘蛋白和波形蛋白）。比例尺：100μm。*P0.01，***P0.001。每组n=30。

  2 高脂饮食改变了Apcmin/+小鼠肠道微生物群的组成和粪便胆汁酸谱众所周知，HFD可诱导小鼠肠道微生物群失调。为了确定ND组和HFD组肠道微生物组的变化，个人会使用基于16S rRNA的高通量测序技术来确定小鼠粪便微生物组的组成。使用维恩图确定不同组的唯一和共享OTU（图2A）。HFD组有276个OTU，ND组有307个OTU，共有222个OTU。当使用主成分分析（PCA）分析两组之间的差异时，各组的肠道微生物群组成显示出明显的聚集性，并不相似（图2B）。在门水平上，两组之间的微生物群落组成不同。在HFD组中，厚壁菌和放线菌的相对丰度随着拟杆菌的减少而升高，并且厚壁菌/拟杆菌的比率同时增加

  （图2C）。然后，个人会使用Chao指数揭示HFD喂养的小鼠与ND喂养的小鼠相比细菌丰富度较低（图2D）。相似性分析（ANOSIM）和代表β多样性的热图显示两组之间有显著差异（图2E，F）。接下来，使用LEfSe分析来估计ND组和HFD组之间的差异丰富物种。患有HFD的小鼠有较高水平的机会性病原体，包括肠球菌、链球菌、Lachnoclostridium、Alistipes和Desulfovibrio。相反，与ND组相比，HFD组的有益细菌，如Candidatus Arthromitus、Marvinbryantia和Parasutterella相对较少（图2G）。 为了研究HFD干预引起的粪便BAs的动态变化，采用液相色谱-质谱法对粪便中的BAs进行定量分析。如图2H所示，HFD导致Apcmin/+小鼠的初级BAs不成比例增加，次级BAs显著增加。尤其是HFD组的粪便DCA水平增加了600倍以上。我们通过Spearman相关分析进一步探讨了BA谱与肠道微生物群组成之间的关系（图2I）。有趣的是，Mucispirillum、Blautia、乳酸杆菌、副杆菌、肠球菌、大肠杆菌和链球菌与继发性BAs（如DCA、wMCA、HDCA、LCA、TDCA、6-酮LCA和NorDCA）呈正相关，而与原发性BAs（如TUDCA、CDCA、CA、TaMCA和TbMCA）呈负相关。更重要的是，这些微生物属具有形成胆盐水解酶（BSH）的共同功能，该酶催化共轭初级BAs的水解。大多数这些微生物在HFD组更丰富。总之，这一些数据表明

  A. 维恩图。B. 两组粪便细菌的主成分分析（PCA）。C. 两组在门水平上微生物群落组成的差异。D. Chao指数。E. 基于加权UniFrac距离的方差分析。F. 热图显示出明显的差异。G. 通过效应大小线性判别分析（LEfSe）生成的分支图中差异丰富的物种。H. 检测用ND或HFD治疗的Apcmin/+小鼠的粪便胆汁酸（BAs）水平，表明HFD中的脱氧胆酸（DCA）非常明显升高。I. 几种显著变化的粪便BAs与细菌属之间的Spearman相关分析。*P0.05，**P0.01，***P0.001。ND，n=5；HFD，n=8。

  进行了进一步的研究，以确定单独使用DCA是否足以诱发HFD的类似效应（图3A）。DCA治疗后小鼠的生活状态没有差异，没有一只小鼠死亡。在食物摄入量没有差异的情况下，两组的体重都逐渐增加，但未曾发现差异（P0.05，图3A）。DCA组小肠和结肠的平均肿瘤数量分别增加约1.6倍（11.10±0.90 vs 18.30±1.21，P0.001）和2.6倍（0.70±0.26 vs 1.80±0.29，P0.05）（图3B）。

  与对照组相比，DCA组小肠各节段的肿瘤数量明显地增加（图3C）。此外，DCA组各种大小的肿瘤数量增加，主要是直径为1-2 mm和2 mm的肿瘤（1-2 mm:4.80±0.61 vs 8.00±0.77，P0.01；2 mm:1.10±0.31 vs 3.80±0.63，P0.01，图3D）。更重要的是，形态学显示对照组仅观察到少量散在的小息肉，而DCA组观察到较大的肿瘤，尤其是结肠肿瘤（图3E）。组织病理学上，在DCA治疗的小鼠中，70%（7/10）被证实患有高度发育不良（HGD）或粘膜内癌，而对照组中只有20%（2/10）被认为患有HGD或粘膜内癌，另有40%（4/10）被发现患有低度发育不良（LGD；图3F）。总之，这些根据结果得出DCA能够在一定程度上促进肠道癌变。

  A. Apcmin/+小鼠饮用无菌水或含有0.2%DCA的无菌水12周的实验流程图。DCA组和对照组之间的体重没有显著差异。B. DCA组每只小鼠的肠道肿瘤总数增加。C 和D. 在DCA组中，近端、中部和远端小肠肿瘤的数量和大小明显地增加。E. 两组的小肠和结肠均显示有代表性的肿瘤宏观图像。F. 他喜欢染色*P0.05，**P0.01，***P0.001。每组n=10。

  为了更好地了解DCA对肿瘤进展的影响，我们进一步检测了肠道肿瘤组织中的增殖和凋亡。DCA组Ki-67阳性细胞的百分比明显地增加（28.12%±2.57% vs 51.9%±3.60%，P0.001，图4A）。同时，与对照组相比，通过TUNEL检测，DCA组的凋亡细胞数量减少（15.90%±1.62% vs 9.20%±1.26%，P0.01，图4B）。DCA组的β-连环蛋白状态也明显地增加，表明

  5 脱氧胆酸驱动Apcmin/+小鼠的血管生成拟态形成和上皮-间充质转化过程在确认DCA可促进Apcmin/+小鼠肠道肿瘤的恶性进展后，我们研究了DCA与VM形成之间的关系，VM形成与肠道肿瘤进展紧密关联。与对照组相比，DCA组有更多的VM通道，这些通道由肿瘤细胞而不是内皮细胞排列

  （图5A）。VE钙粘蛋白是一种跨膜蛋白，负责细胞间粘附，与VM的形成呈正相关。DCA处理在mRNA和蛋白质水平上增加了VE钙粘蛋白（图5B-D）。 与对照组相比，DCA显著抑制上皮标记物（claudin-4和E-cadherin）的表达，并增加间充质标记物（波形蛋白和纤维连接蛋白；图6A，B）的表达。EMT相关蛋白的表达，包括E-钙粘蛋白和波形蛋白，也使用western blot分析进行仔细的检测，结果与实时PCR相似（图6C，D）。如图6E所示，免疫组织化学染色显示DCA降低了E-钙粘蛋白的表达，增加了波形蛋白的表达，与上述分析一致。总的来说，这些结果表明

  6 脱氧胆酸加速HCT-116细胞的上皮-间质转化过程、血管生成拟态形成和迁移

  低浓度的DCA（50μM）促进细胞增殖，但过高浓度的DCA可能由于毒性作用导致大量细胞坏死

  用20 μM DCA处理HCT-116细胞24 h后，波形蛋白表达非常明显升高，E-钙粘蛋白表达水平明显降低（图7B，C）。然后我们从mRNA水平分析实验结果，与western blot分析一致（图7D）。利用体外建立的三维模型研究了DCA对HCT-116细胞VM形成的影响。我们得知，与对照组相比，经20 μM DCA处理的HCT-116细胞形成了更典型和完整的血管样管（图7E）。此外，伤口愈合实验证实，经20 μM DCA处理的HCT-116细胞具有较高的迁移率和较窄的伤口面积，表明DCA促进了细胞迁移（图7F）。总之，DCA加速了HCT-116细胞的EMT过程、VM形成和迁移，从而使肿瘤细胞具有更多的侵袭性和表型。

  A. 用细胞计数试剂盒8（CCK-8）测定不同浓度和时间DCA处理HCT-116细胞的增殖能力。B和C. 在用DCA处理的HCT-116细胞中检测波形蛋白和E-钙粘蛋白的表达水平，以及浓度和时间变化。D. DCA处理的HCT-116细胞中上皮-间充质转化（EMT）标记物的mRNA水平。E. 介绍了三维培养模型中血管样管状结构的图像。在倒置显微镜下计数相应的图案化网络的数量。F. 伤口愈合实验表明DCA加速了HCT-116细胞的迁移。对两组伤口闭合的定量测量结果做多元化的分析。比例尺：100μm。*P0.05，**P0.01，***P0.001。

  7 脱氧胆酸激活Apcmin/+小鼠的血管内皮生长因子受体2信号通路血管内皮生长因子受体2在许多癌症中过度表达，并参与转移和复发。我们得知与对照组相比，DCA组VEGFR2的mRNA水平非常明显升高；然而，未观察到VEGFR1水平的显著变化（图8A）。考虑到EMT相关转录因子在EMT中的作用，我们还测量了肠道肿瘤组织中的ZEB1和ZEB2 mRNA水平，DCA处理的小鼠的水平明显高于对照组（图8A）。使用western blot分析，我们研究了VEGFR2的表达及其磷酸化指数，发现VEGFR2和p-VEGFR2在DCA组中过度表达

  与对照组小鼠相比，DCA处理的小鼠在肠道肿瘤中表现出较高的p-VEGFR2表达（图8C）。

  8 血管内皮生长因子受体2的沉默影响脱氧胆酸诱导的HCT-116细胞上皮-间充质转化过程、血管生成拟态形成和迁移将血管内皮生长因子受体2 siRNA转染HCT-116细胞，以对照siRNA作为对照，探讨VEGFR2是否是DCA诱导的EMT和VM所必需的。通过westernblot分析确定转染效率（图9A）。由于VEGFR2转染，DCA处理的HCT-116细胞中ZEB2 mRNA表达升高受到抑制（图9B）。VEGFR2的缺失降低了DCA引起的E-钙粘蛋白的表达并提高了波形蛋白的表达水平，突出了VEGFR2在DCA诱导的EMT过程中的关键作用

  VM是指侵袭性肿瘤细胞形成新生血管网络，为快速生长的肿瘤提供潜在的灌注途径，并增加临床预后不良的风险。因此，能够直接进行进一步的研究，以探索影响VM形成的潜在致癌危险因素和相关机制。在本研究中，我们得知HFD显著促进结直肠癌患者VM的形成和EMT，提示饮食、VM和结直肠癌之间有联系。

  研究表明HFD通过肠道微生物群失调和微生物群相关代谢物的改变促进结直肠肿瘤的发生。与此一致，我们得知HFD喂养的Apcmin/+小鼠表现出独特的肠道微生物群组成和多样性，这改变了胃肠道微生物衍生代谢物的产生。BAs是一类代表肠道微生物群与宿主共代谢的代谢物。长期食用HFD会导致BA代谢异常。正如我们的研究所表明的，